抗體標記實驗技術

抗體標記簡介

抗體標記原理下載抗體標記是指將標記物(酶,熒光素,生物素等)共價連接到抗體上,與待檢測物(如某些特定抗原)特異性反應形成多元復合物,并借助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發光免疫測定儀等精密儀器對試驗結果直接鏡檢觀察或進行自動化測定,可以在細胞、亞細胞、超微結構及分子水平上對抗原、抗體反應進行定性和定位研究或應用各種液相和固相免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進行定性和定量測定。目前抗體標記技術己被廣泛用于醫學病理學、免疫組織化學、分子生物學、生物制藥等領域的分析研究與技術測定,常見的抗體標記技術包括酶標記法,生物素化標記法,熒光素標記法和膠體金標記法等。

常用的抗體標記技術

1.抗體的酶標記法

通過共價鍵經適當方法將酶聯結在抗體上,制成酶標抗體,再借酶對底物的特異催化作用,生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒,這些有色產物可用肉眼、光學顯微鏡和電子顯微鏡觀查,也可以用分光光度計測定,呈色反應顯示了酶的存在,從而證明發生了相應的免疫反應。
實驗中使用偶聯劑使酶與抗體結合,即通過應用單、雙或多功能試劑,分別與大分子的抗體所存在的功能性基團發生反應,生成酶—抗體偶聯復合物。不同的酶—抗體復合物制備方法中,最廣泛應用的戊二醛法,本法與其它偶聯方法相比,具有操作簡單、反應條件溫和,及實用面廣等長處。
酶標記抗體的質量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體,其次要有良好的制備方法。高質量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,宜選用產率高、不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質且操作簡便易行的方法。

1) 辣根過氧化物酶(HRP)

辣根過氧化物酶(HRP)標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基,加入抗體IgG后該醛基與 IgG氨基結合,形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發生偶合,在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了,用硼氫化鈉穩定Schiff氏堿。

操作步驟:
  • 將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液,混勻,蓋緊瓶塞,室溫避光作用2小時。
  • 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。
  • 加入0.75ml小鼠已處理的腹水,或純化單抗等(15mg/ml),混勻。
  • 稱取Sephadex G25干粉0.3g,加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內;隨后將上述交聯物移入注射器外套;蓋緊,室溫作用(避光)3小時或4℃過夜。
  • (用少許PBS將交聯物全部洗出,收集洗出液,加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液,混勻,室溫作用30分鐘;再加入3/20V NaBH4溶液,混勻,室溫作用1小時(或4℃過夜)。
  • 將交聯物過Sephadex G200或Sepharose 6B(2.6×50cm)層析純化,分管收集。
  • 酶結合物質量鑒定:
    克分子比值測定
    酶量(mg/ml)=OD403×0.4
    IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62
    克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量,一般在1-2之間。酶結合率=酶量×體積/抗體,標記率一般為0.3-0.6,即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子上,標記率可大于0.6,0.8,0.9;OD403/OD280等于0.4時,E/P約為1。
    標記率=OD403/OD280
    酶活性和抗體活性的測定可應用ELISA法、免疫擴散、DAB-H2O2顯色反應測定酶結合物的酶活性,抗體活性及效價、特異性。
  • HRP抗體結合物的保存:加入等量甘油后,小量分裝-20℃存放,防止反復凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否則會影響酶活性。必要時凍干保存,以BSA或脫脂牛奶作保護劑。

2) 堿性磷酸酶(AKP)

堿性磷酸酶(AKP)用于標記抗體,常用戊二醛一步法,將酶和單抗混合,再加入適量戊二醛,使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結合,制備成結合物。該法簡便,但所得產物不均一,抗體活性損失大,酶標記率低。

操作步驟:
  • 將5mg AKP加入1ml抗體溶液(2mg/ml)中溶解,裝入透析袋,于4℃對0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時,換液三次。
  • 加入2.5%戊二醛20ul,室溫作用1-2小時,4℃對PBS透析過夜,其間換液三次。
  • 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析,4℃過夜,換液三次。
  • 取出標記抗體,用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml,即為AKP標記物原液。
  • 每毫升中加入0.4ml甘油,小量分裝,保存備用。

2.抗體的生物素化標記

親和素與生物素都可與蛋白質(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結合而不影響后者的生物活性,是理想的標記劑。一個抗體分子可偶聯數十個生物素或親和素分子,而親和素或生物素分子又可與酶或熒光素結合,從而組成一個生物放大系統,顯著提高檢測的靈敏度。常用的有親和素–生物素標記法(Labeled avidin biotin,LAB)、親和素-生物素橋法(bridged avidin biotin, BAB)和親和素-生物素-過氧化物酶復合物法(avidin biotin peroxid ase complex,ABC)。本實驗可使抗體或其它蛋白質的ε-氨基通過手臂與酰化的生物素共價結合。其后,生物素化的分子可應用酶標-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復合物來檢測。

操作步驟:
  • 將待生物素化的蛋白質用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6)稀釋到1mg/ml,一般實驗室應用的生物素化體積為1-2.5ml;
  • 交互用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5 mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6),對蛋白質充分透析;
  • 用1ml DMSO溶解生物素琥珀酰亞胺酯(NHSB)1mg;
  • 向1ml蛋白質溶液(即含蛋白質1mg)加入120μl NHSB溶液(即含NHSB 120 μg);
  • 在室溫下持續攪拌,保溫2-4小時;
  • 加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl),在室溫下攪拌10分鐘;
  • 在4℃,對PBS充分透析,以除去游離的生物素;
  • 將樣品上1ml的分子篩柱,以PBS緩慢洗脫,收集1ml/管,蛋白質在1-3ml之間洗下;
  • 最后,樣品加入疊氮鈉(終濃度0.5g/L)及1.0g/L
  • BSA。將結合產物置4℃,避光保存,亦可加入50%重蒸甘油,置―20℃保存。

實驗要點及說明
  • 如在反應混合液中有疊氮鈉或游離氨基存在,會抑制標記反應。因此,蛋白質在反應前要對0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液或0.5 mol/L硼酸緩沖液充分透析;
  • 所用的NHSB及待生物素化蛋白質之間的分子比按蛋白質表面的ε-氨基的密度會有所不同,選擇不當則影響標記的效率,應先用幾個不同的分子比來篩選最適條件;
  • 用NHSB量過量也是不利的,抗原的結合位點可能因此被封閉,導致抗體失活;
  • 由于抗體的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此時可加入去污劑如Triton X-100,Tween 20等。
  • 當游離ε-氨基(賴氨酸殘基的氨基)存在于抗體的抗原結合位點時,或位于酶的催化位點時,生物素化會降低或損傷抗體蛋白的結合力或活性。此時,應試用其它交聯方法;
  • 生物素還可能與不同的功能基團,如羰基、氨基、巰基、異咪唑基及苯酚基,也可與糖基共價結合;
  • 交聯反應后,應充分透析,否則,殘余的生物素會對生物素化抗體與親和素的結合產生競爭作用;
  • 在細胞的熒光標記實驗中,中和親和素的本底低,但由于鏈霉親和素含有少量正電荷,故對某些細胞可導致高本底。

3.抗體的熒光標記法

熒光抗體標記技術是將熒光素以化學方法與特異性抗體共價結合,形成熒光素-蛋白質結合物(即熒光標記抗體),此結合物仍保留著抗體活性,同時具有熒光素的示蹤作用。當它與相應的抗原特異結合后,借助于熒光顯微鏡觀察呈現明亮的特異熒光。實驗中常用異硫氰基熒光黃(fluorescein isothiocyanate, FITC)作為標記物,在堿性溶液中,FITC上的化學基團異硫氰基(-N=C=S)與抗體蛋白自由氨基(主要是賴氨酸的ε-氨基)結合,形成熒光抗體,以測定細胞相應抗原的存在。FITC具有很高的量子產量(發射光與吸收光的比值,0 .85),而且形成的偶聯物的穩定性很好。FITC是應用最廣的熒光染料,流式細胞儀就按FITC的特性,設計了激光波長為488 nm,很接近于FITC的最大激發波長492nm)。

作為標記的熒光素應符合以下要求:
  • 應具有能與蛋白質分子形成共價健的化學基團,與蛋白質結合后不易解離,而未結合的色素及其降解產物易于清除。
  • 熒光效率高,與蛋白質結合后,仍能保持較高的熒光效率。
  • 熒光色澤與背景組織的色澤對比鮮明。
  • 與蛋白質結合后不影響蛋白質原有的生化與免疫性質,與蛋白質的結合物穩定,易于保存。
  • 標記方法簡單、安全無毒。
操作步驟:
  • 用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋抗體為1-5mg/ml,或抗體對該緩沖液充分透析,以足以使賴氨酸不解離(去其正電荷),但注意保持大部分蛋白質仍未變性;
  • 將透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml 的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中,用鋁鉑包燒杯以避光,4℃攪拌過夜;
  • 上述抗體液對PBS在4℃透析以終止反應。其間至少更換PBS液三次,直致480nm 的吸收為零;
  • 加入0.5g/L 的疊氮鈉。此后,結合物在4℃避光保存,或分裝后在-20℃凍存。
熒光偶聯質量的檢測
  • 用標準免疫熒光染色試驗以測定偶聯率。
  • 或用F/P值測定對其FITC標記質量進行鑒定。
  • 取結合物液0.2ml,加PBS 2.8ml(或兩者均改用半量),測定其A490/A280,查 FITC標志曲線得其濃度μg/ml值,按IgG的消光系數(mg/ml約A280 1.2),可計算其F/P值,即每mg抗體所標記的FITC的比值,以此鑒定及比較各批標記物的質量。
實驗要點及說明
  • 偶聯反應要求在盡可能接近pH9.8的溶液中進行,而且注意在反應過程中要保持此pH水平;
  • 要確定在偶聯反應緩沖液中不含游離氨基(Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應,因此會降低蛋白質與FITC的偶聯率);
  • FITC與蛋白質的比值(F/P),可通過測定495nm與280nm吸光度來鑒定。此比值的范圍應為0.3-1.0(方法見前);
  • FITC唯一的缺限是易被光淬滅,因此復合物必須始終避光保存;
  • 如果FITC-復合物對PBS透析不充分,可能造成高本底,對免疫熒光染色產生干擾;
  • 如果被標記的蛋白質是第二抗體或通用的第一抗體,則從商品購置可能更方便可取。

4.免疫膠體金標記抗體及檢測抗原

膠體金是一種常用的標記技術,是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術,有其獨特的優點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學以至生物芯片中都可能利用到。
膠體金在光鏡和電鏡中均為有效的標記物,可以檢測單一和多重抗原。膠體金在電解質中不穩定,但被蛋白質包被的膠體金是穩定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被膠體金,可作標記二抗進行免疫檢測,本方法應用范圍廣,染色后的樣品可以長期保存。

操作步驟
  • 膠體金溶液制備
    • 稱取0.1g 氯金酸鈉,溶解于1L去離子水中;
    • 加熱煮沸,劇烈攪拌下,迅速加入25ml新配的1%檸檬酸鈉溶液;
    • 繼續煮沸5分鐘,至溶液變成桔紅色;
    • 用蒸餾水將溶液的525 nm波長下的光密度吸收值調到 0.8。
  • 膠體金的包被
    • 將山羊抗鼠Ig抗體離心30分鐘;
    • 上清液經0.2 nm 濾膜過濾;
    • 確定蛋白質包被的最佳濃度:將蛋白質作連續10倍稀釋各1ml,加入5ml膠體金溶液,1分鐘后加入1ml
    • 10%氯化鈉溶液,靜止5分鐘;以膠體金溶液為空白對照測定光吸收度,選擇最低吸收值的蛋白質濃度用于正式包被。

    • 取50ml膠體金溶液,用0.2M K2CO3調pH值為7.6,按照確定的最佳比例將蛋白質加入并快速混合,讓蛋白質吸附2分鐘后,加0.5ml 1%聚乙二醇,防止非特異性凝集;
    • 離心1小時,棄上清液,將膠體金懸浮于含 1% 聚乙二醇的 PBS中;重復一次;
    • 棄去上清液,將包被的膠體金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀釋, 經微孔濾膜過濾后,4℃保存。
  • 抗原檢測
    • 取20ul人外周血白細胞與5l T淋巴細胞特異的單克隆抗體在4℃下孵育30分鐘;
    • 1000 r/min離心清洗細胞5分鐘,2次;
    • 將洗滌后的細胞與20l(一般效價1:20)膠體金標記的山羊抗鼠Ig抗體在室溫下孵育30-60分鐘;
    • 1000 r/min離心清洗細胞5分鐘,2次;
    • 將細胞涂片于載玻片,用1% 戊二醛固定細胞10分鐘,清洗多余固定液;
    • 將載玻片細胞面向上置于放有濕潤濾紙的培養皿中,加4滴50%硝酸銀溶液和2滴明膠顯色液,覆以蓋玻片,放入60-65℃的溫箱中,顯色3-4分鐘,直至玻片標本呈現金褐色為止;
    • 移出蓋玻片,用蒸餾水迅速漂洗數秒,晾干;
    • 光學顯微鏡下觀察。
實驗要點及說明
  • 所使用的器皿均應非常潔凈,需經過硅烷化處理;
  • 使用高純度多次蒸餾去離子水;
  • 膠體金顆粒的形成、大小和速度,均決定膠體溶液的穩定性,水質和玻璃表面對啟動還原和穩定膠體十分重要,本過程制備的膠體金顆粒直徑約為18-20 nm;
  • 因為膠體金在電解質中不穩定,本實驗全部操作過程要嚴格、迅速,注意液體顏色;
  • 蛋白質包被膠體金時的相對最佳濃度要事先測定,測定最佳濃度時,膠體金溶液的pH值也要調節到pH7.6;
  • 一抗和膠體金標記二抗的稀釋濃度應事先經預試驗以最佳效價。

相關服務

抗體標記服務:提供生物素標記,FITC熒光標記,HRP標記等。

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