免疫組化技術

免疫組化技術的全稱為免疫組織化學技術(Immunohistochemistry,IHC)。下載免疫組化于上世紀40年代出現,在60年代后發展迅速,經歷了幾十年的快速發展,該技術應用范圍已覆蓋到醫學各個學科,已經成為當今生物醫學形態、功能、代謝綜合研究的一項有力工具。

免疫組化實驗流程

什么是免疫組化技術(IHC)?

免疫組化,是用標記的特異性抗體對組織內抗原的分布進行定性,定位分析的檢測技術。

免疫組化技術原理

免疫組化技術原理是:從待檢測組織或細胞中提取蛋白作為抗原,通過免疫動物獲得特異性抗體,利用抗體探測并結合組織(或細胞)中的抗原。再利用帶顯色劑標記的二抗檢測,對細胞復染顯示細胞輪廓,通過顯微鏡觀察,可以實現對組織或細胞內蛋白的定性、定位研究。

免疫組化技術與WB、ELISA區別

免疫組化、Western Blot、ELISA被稱為免疫學三大工具,分別用于定位,定性和定量檢測。

免疫組化 Western Blot ELISA
實驗原理 免疫反應;化學顯色反應 免疫反應;化學顯色反應 免疫反應;化學顯色反應
檢測樣品 組織石蠟切片或冰凍切片 蛋白 血清、細胞、組織培養上清等
定位檢測
定位檢測
定量檢測 半定量[1] 半定量 定量檢測
表1:免疫組化、Western Blot、ELISA的區別

免疫組化技術應用

定位和定性是免疫組化最大的優勢。相比于其他蛋白檢測方法,免疫組化具有定位較直接準確、定性靈敏度高,是定位檢測分析首選方法,尤其對于有些因子的轉位研究十分有用。免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面:

  • 惡性腫瘤的診斷與鑒別定性;
  • 確定轉移性惡性腫瘤的原發部位;
  • 對某類腫瘤進行進一步的病理分型;
  • 軟組織腫瘤診斷;
  • 為臨床提供治療方案的選擇;

近年來,隨著免疫組織化學技術的發展和各種特異性抗體的出現,使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可,其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時,準確率可達50%-75%。

免疫組化實驗步驟

根據標記物的不同(標記物有熒光染料、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金等),免疫組化方法可以分為:免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中比較常用的是免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學法,本文以免疫酶法為例,對免疫組化的操作流程做一介紹。

實驗步驟

免疫酶法的實驗流程為:對事先制備好的組織石蠟切片進行脫蠟與水化→細胞通透→抗原修復→封閉特異性蛋白→孵育及染色→脫水、封片、鏡檢。根據孵育與顯色反應等步驟操作方法的不同,可以將免疫酶法進一步分為Elivision二步法、SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法)、ABC法(卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法)、SABC法(鏈霉卵白素-辣根酶標記生物素法)等方法。

即用型Elivision快速酶免疫組化二步法的孵育及顯色流程:一抗+酶標二抗+辣根酶底物顯色。
SP法的孵育及顯色流程:一抗+生物素二抗+滴加試劑SP(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物)+辣根酶底物顯色,SP是最常用的實驗方法。
ABC法的孵育及顯色流程:一抗+生物素二抗+滴加試劑ABC(卵白素-生物素-過氧化物酶復合物)+辣根酶底物顯色。
SABC法的孵育及顯色流程:一抗+生物素二抗+滴加試劑SABC(鏈霉卵白素-辣根酶標記生物素復合物)+辣根酶底物顯色。

  • 脫蠟與水化:脫蠟與水化的目的是確保抗體能夠充分與組織中抗原結合發生反應。
  • 細胞通透:細胞通透的目的是使抗體能充分的進入胞內進行結合反應。一般用Triton X-100、蛋白酶K等通透液對細胞進行通透。
  • 封閉內源性過氧化物酶:封閉內源性過氧化物酶的主要目的是降低內源性過氧化物酶活性。在傳統的ABC法和SP法等方法中,免疫組化反應結果容易受到內源性過氧化物酶的影響,必須用H202等進行滅活。
  • 抗原修復、暴露抗原決定簇:在石蠟切片制備過程中,組織中部分抗原由于發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用從而失去抗原性,需要通過抗原修復,使細胞內抗原決定簇重新暴露。
  • 封閉非特異性蛋白:組織切片上有些剩余的位點可以與抗體非特異性結合,造成后續結果的假陽性,因此要進行非特異性蛋白封閉。封閉血清通常選擇與二抗同一來源的非免疫血清,血清中有一些動物自身的抗體,預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合,從而避免了抗體與組織切片的非特異性結合。
  • 一抗孵育:通過孵育使一抗特異性的結合底物。
  • 二抗孵育:二抗帶有生物素標記(二步法二抗帶有的標記為顯色標記),孵育后二抗與一抗結合,目的是檢測一抗。
  • 染色:常用的染色方法有SP法、ABC法、SABC法等。其原理是利用抗生物素蛋白或卵白素與二抗上的生物素結合,從而間接達到將顯色劑與二抗結合的目的。
  • 顯色:在免疫組化中,由于抗原抗體形成的復合物本身沒有顏色,不能直接觀察,只能借助于其他某些化學基團的顯色作用(例如酶與底物的顯色反應),使復合物顯色,便于在顯微鏡下觀察。
  • 復染:復染的目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進行定位,常用的復染試劑為蘇木素。
  • 脫水、透明、封片、鏡檢

結果分析

免疫組化實驗通常需要設置陽性對照、陰性對照(或替代對照)(陽性對照是排除方法和實驗系統有無問題;陰性對照與替代對照是排除有無非特異性染色)。
一般情況下,陽性對照顏色的特點為:Ag定位,包漿、胞核、胞膜、間質具有結構性。且染色的強度不同(顏色深淺不一);陰性對照的特點為:染色細胞與組織無區別,顏色具有彌散性,分布均勻。

陽性對照 陰性對照
(或替代對照)
實驗組 結論
操作錯誤
+ + + 非特異性反應
+ + 陰性對照含定位Ag
+ 陽性對照不含定位Ag
+ 受檢組織非特異性染色
+ + 受檢組織不含定位Ag
+ + 受檢組織含定位Ag
表2:免疫組化實驗可能出現結果分析對照表

注:+表示實驗有特異性染色;-表示實驗無特異性染色
上表為免疫組化實驗中可能出現的結果,由上表可以看出,只有6、7組的實驗結果有意義。1~5的實驗結果因IHC技術操作存在錯誤等原因使對照組的實驗結果失去對照意義,必須重復實驗或者換用Ab。
說明:免疫組化實驗可以對結果進行定量分析,但要實驗得到的必須是高質量的染色切片,要求背景染色淺且特異性染色較深,這樣分析的結果才會比較準確。

實驗失敗常見問題分析:

  • 免疫組化實驗FAQ為什么在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陰性?
    答:這種現象主要是由操作不當導致,可能的原因有:1.染色操作不當,致使染色失敗;2.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒有活性;3.緩沖液中有疊氮化鈉,抑制了酶的活性;4.復染或脫水劑使用不當等。建議逐一排查,找到原因后重新進行實驗。
  • 在顯微鏡下觀察發現所有的切片都成陽性,這是為什么?
    答:與上一個問題類似,出現的原因也是試驗操作存在問題,可能的原因有:1.切片在染色過程中抗體過濃,或者干片了;使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應時間過長;3.抗體溫育的時間過長等。
  • 在顯微鏡下觀察發現切片的背景很深,這是為什么?
    答:以下幾方面會導致切片的背景過深:1. 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血,造成抗體的非特異性反應;2. 內源性過氧化酶沒有完全阻斷,顯色過程中過氧化酶與酶底物反應,造成背景;3.底物呈色反應時間過長或呈色反應后漂洗不徹底。

注意事項

  • 切片脫蠟和水化要充分,加反應液時要覆蓋組織充分;每次加液前甩干洗滌液,同時防止干片。
  • 一抗的沖洗原則:單獨沖洗,防交叉反應污染;溫柔沖洗,防止切片脫落;推薦浸洗方式。
  • 有條件的話最好立即拍照,若不能及時拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。

注釋:[1] 半定量是介于定性與定量之間的一種分析方法, 指雖然可以得到一個量值,但是這個量值只能從趨勢上進行分析,例如大量、少量、微量、痕量等,而得不到一個具體的數值(例如濃度等)。

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

幸运农场三连中