蛋白純化填料再生實驗操作

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親和層析填料

相關閱讀:蛋白質親和純化
鎳柱的回收:

  • 將使用完的鎳柱用對應的含500mM咪唑的變性或非變性的洗脫液沖洗至基線。
  • 加入DDH2O沖洗3—5個柱體積。
  • 用20%的乙醇沖洗3—5個柱體積。
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中等待再生。

鎳柱的再生:

  • 取待再生的鎳柱,將其倒入砂芯漏斗中(實驗室的濾孔是40uM,大小選擇可參考具體的鎳柱說明書),濾除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 鹽酸胍,0)沖洗柱子,V柱子:V鹽酸胍=1:4。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5%SDS沖洗柱子,V柱子:VSDS =1:2。(若SDS析出,用50%乙醇稀釋沖洗直至正常)
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(20mM Tris ,100mMEDTA ,PH8.0)沖洗柱子,直至柱子的顏色由藍色變成白色,V柱子:VEDTA =1:5至1:10。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子與考馬斯亮藍G250反應,無顏色變化方可進行下一步操作,若變藍則繼續重復上述步驟,直至無顏色反應)
  • 加入100mMNiSO4于塑料容器中,V柱子:VNiSO4 =1:3。將其放入15℃,100r/min 的搖床中孵育結合10小時以上(或者過夜),靜置后濾除NiSO4溶液,加入等體積的20%的乙醇放置4℃層析柜中待用。

GST柱的回收:

  • 將使用完的GST柱用洗脫緩沖液洗至基線。若洗不掉著用(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 鹽酸胍,0)沖洗柱子至基線。
  • 加入DDH2O沖洗3—5個柱體積。
  • 用20%的乙醇沖洗3—5個柱體積。
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中等待再生。

GST柱的再生:

  • 取待再生的GST柱,將其倒入砂芯漏斗中(實驗室的濾孔是40uM,大小選擇可參考具體的GST柱說明書),濾除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入(50mM Tris ,150mMNaCl ,6M 鹽酸胍,0)沖洗柱子,V柱子:V鹽酸胍=1:4。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入50%乙醇沖洗柱子,V柱子:V乙醇 =1:4。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子與考馬斯亮藍G250反應,無顏色變化方可進行下一步操作,若變藍則繼續重復上述步驟,直至無顏色反應)
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中待用。

離子交換層析填料

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陰離子/陽離子填料的回收:

  • 將使用完的離子柱用對應PH的含500mMNaCl的變性或非變性的緩沖液沖洗至基線。
  • 加入DDH2O沖洗3—5個柱體積。
  • 用20%的乙醇沖洗3—5個柱體積。
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中等待再生。

陰離子/陽離子填料的再生:

  • 取待再生的離子柱,將其倒入砂芯漏斗中(實驗室的濾孔是40uM,大小選擇可參考具體的離子柱說明書),濾除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入1MNaCl沖洗柱子,V柱子:VNaCl =1:5。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH沖洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根據污染程度調整NaoH的濃度,不超過1M)
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(取少量柱子與考馬斯亮藍G250反應,無顏色變化方可進行下一步操作,若變藍則繼續重復上述步驟,直至無顏色反應)
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中待用。

分子篩填料的回收與再生SOP

相關閱讀:凝膠過濾色譜純化蛋白
凝膠柱填料的回收:

  • 將使用完的凝膠柱填料用對應的緩沖液以3ml/min的流速沖洗至基線穩定。
  • 加入DDH2O沖洗3—5個柱體積。
  • 用20%的乙醇沖洗1-2個柱體積。
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中等待再生。

凝膠柱填料的再生:

  • 將待再生的柱子,將其倒入砂芯漏斗中(實驗室的濾孔是40uM,大小選擇可參考具體的凝膠柱說明書),濾除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH沖洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根據污染程度調整NaoH的濃度,不超過1M)
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(6)(取少量柱子與考馬斯亮藍G250反應,無顏色變化方可進行下一步操作,若變藍則繼續重復上述步驟,直至無顏色反應)
  • 將填料裝柱,用水壓實,并連上蛋白純化儀器,以恒定流速3ml/min通入DDH2O壓實,(基線穩定)待用。

疏水層析填料

疏水層析填料的回收:

  • 將使用完的疏水柱用不含對應鹽的變性或非變性的緩沖液沖洗至基線。
  • 加入DDH2O沖洗3—5個柱體積。
  • 用20%的乙醇沖洗3—5個柱體積。
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中等待再生。

疏水層析填料的再生:

  • 將帶再生的柱子,將其倒入砂芯漏斗中(實驗室的濾孔是40uM,大小選擇可參考具體的疏水柱說明書),濾除20%的乙醇。
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。
  • 加入5MNaoH沖洗柱子,V柱子:VNaoH=1:5。(可根據污染程度調整NaoH的濃度,不超過1M)
  • 加入DDH2O沖洗柱子,V柱子:VH2O =1:5。(4)(取少量柱子與考馬斯亮藍G250反應,無顏色變化方可進行下一步操作,若變藍則繼續重復上述步驟,直至無顏色反應)
  • 將其儲存在20%的乙醇中,放置4℃層析柜中待用。
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