GST pull down實驗流程

本文主要介紹了GST pull-down實驗的服務流程(數據以實際實驗為準)下載

GST蛋白的表達

  1. 將表達GST融合蛋白的質粒轉入BL21大腸桿菌菌株中;
  2. 挑單克隆于3ml?LA(LB+Amp)培養基中,37℃搖菌過夜,獲得種子液;
  3. 將種子液稀釋于50ml 2x YT A(YTG+Amp)培養基中,使起始OD600為0.1;
  4. 28℃,220rpm搖菌培養2小時?;
  5. 加入50μl?100mM?IPTG,16~27℃搖菌培養1~8小時;
  6. 收菌,將菌液倒入大離心管,2管/50ml菌液,4℃?5000rpmx5min離心,棄上清;
  7. 加入10ml?PBS/管,重懸細胞,5000rpm離心5min,棄上清;
  8. 超聲破壁,將裂解液分入1.5ml離心管中,4℃離心12000rpm×10min,取上清;
  9. 吸取少量上清,加入蛋白電泳上樣緩沖液,在沸水中煮3min,離心(12000rpm,1min),取上清SDS-PAGE電泳,檢測表達情況;

gst-pull-down

gst pull down 實驗流程

準備50% GST瓊脂糖凝膠

  1. 將原75%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠的漿液彈至混勻;
  2. 取677μl原液/管,3000rpm離心5min,棄上清;
  3. 加500μl?PBS,顛倒混勻,3000rpm離心5min,棄上清,反復5次;
  4. 加500μl?PBS,顛倒混勻,配成50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠備用;

GST蛋白的純化

  1. 在新鮮制備的細胞裂解液上清中加入20μl?50%谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B,4℃,搖床上搖,反應30min~60min;
  2. 3000rpm離心5min,棄上清;該瓊脂糖凝膠上即結合了GST融合蛋白,(如果僅僅是做純化效果檢測或者蛋白表達量很高,可以只接合一次,如果要結合更多則接著往下做);
  3. 在管中加入離心后的1.5ml新鮮制備的細胞裂解液的上清,4℃,反應30min~60min。3krpm離心5min,棄上清。重復該步驟多次,就可以使瓊脂糖凝膠上結合6~10ml?裂解液中的GST融合蛋白;
  4. 在管中加入預冷的200μl?PBS(沿壁加入,小心勿劇烈,以免打斷珠子與蛋白的聯接),輕晃懸浮珠子,將瓊脂糖凝膠洗滌一次,?3000rpm離心3min,棄上清;
  5. 反復三次(最后一次以小槍吸凈珠子表面水膜,其余幾次可以中槍吸,盡量吸凈但不吸走珠子),即獲得結合有GST融合蛋白的瓊脂糖凝膠;
  6. 如果用于檢測,在谷胱甘肽加入15~20μl?1×蛋白電泳上樣緩沖液,在沸水浴中煮3min。12000rpm離心1min,取上清作SDS-PAGE電泳;
  7. 結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫;

檢測

  1. 將結合有GST融合蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠懸浮在500μlNETN緩沖液中加入20~30μl含有其他蛋白的溶液同時采用結合有GST空蛋白的谷胱甘肽瓊脂糖凝膠平行操作作為對照;
  2. 在水平搖床上,4晃動4~8小時;
  3. 離心(3600rpm,2min)吸去上清,注意不要擾動底層的瓊脂糖球珠;
  4. 加入200μl緩沖液對瓊脂糖凝膠進行洗滌。注意加入緩沖液時要貼壁加,不要直接沖擊瓊脂糖凝膠,隨后輕柔晃
    動,使其重懸即可;
  5. 低速離心(3000rpm,2min)吸去上清,注意不要擾動底層的瓊脂糖凝膠;重復步驟的洗滌2~3次;
  6. 吸干瓊脂糖凝膠上方的水層后,加入20~30μl?1×蛋白電泳上樣緩沖液,沸水浴4min,凍存于-20℃;
  7. 做SDS-PAGE和Western檢測另一個蛋白;

GST-pull down的對照問題

  1. 做SDS-PAGE時點一個input的蛋白(即B-6*His)陽性對照,看一下Western操作過程中試劑、操作步驟有沒有問題
  2. 谷胱甘肽瓊脂珠上只固定GST蛋白,inputB-6*His,用于做陰性對照,看一下是否GST會與input的蛋白相互作用

相關服務:GST pull-down服務

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