蛋白表達與純化專題

蛋白表達專題:涵蓋四大蛋白表達與純化(原核(大腸桿菌),哺乳動物,酵母系統)介紹、原理、操作步驟及實驗FAQ,內容全面、豐富。
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蛋白表達通常是指生物體內蛋白質的合成、修飾以及調控過程。在表達系統的相關研究中,表達是指利用基因重組技術表達蛋白質的過程。本文主要關注后一個話題,著重闡述重組蛋白生產過程中的主要細胞機制(cellular machinery)。

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蛋白表達與純化簡介

蛋白在細胞內的合成和調控取決于功能的需求,蛋白質的遺傳信息都儲存在DNA的模板中,并由轉錄過程中產生的信使RNA(mRNA)進行解碼,遺傳信息通過一個mRNA編碼,然后翻譯為蛋白質。轉錄是指遺傳信息從DNA傳遞到mRNA的過程,而翻譯是指蛋白通過mRNA指定的序列進行合成的過程。

蛋白表達與純化轉錄
轉錄和翻譯的簡略示意圖,描述了從DNA堿基對序列(基因)到形成氨基酸多肽序列(蛋白質)的過程。

在原核細胞中,轉錄和翻譯是同時進行的。翻譯甚至在成熟的mRNA轉錄產物完全合成前就已經開始了。這種轉錄翻譯同時進行的方式被稱為轉錄翻譯的耦合(coupled)。而在真核細胞中,轉錄發生在細胞核內,翻譯或蛋白合成的場所則是在細胞質中,倆者是分開且依次發生的。

真核原核在蛋白表達純化中轉錄過程
真核和原核的轉錄翻譯對比圖

轉錄

原核生物和真核生物的轉錄的過程都包括三個步驟:起始,延伸和終止。當雙鏈DNA解旋并與RNA聚合酶結合時轉錄開始。一旦轉錄開始,RNA聚合酶就會從DNA中釋放出來。轉錄的過程的調控依賴激活蛋白和阻遏蛋白,同時也與真核的染色質結構有關。在原核生物中,mRNA的原始轉錄產物一般不需要加工修飾,翻譯往往在轉錄完成前就開始了。然而真核細胞中,原始轉錄產物則需要進一步的加工——除去內含子,mRNA的5′端添加“帽子”,mRNA 3′末端在多聚腺苷酸聚合酶參與下加上了一段多個腺嘌呤序列(poly A尾)。修飾后的mRNA移動到細胞質中進行翻譯。

翻譯

翻譯或蛋白的合成是一個復雜的過程,包括起始,延長和終止三個步驟。整個過程需要生物大分子的協同作用,如核糖體,轉運RNA(tRNA),mRNA等;同時還需要很多的蛋白因子和小分子蛋白,如氨基酸,ATP,GTP以及其它輔助因子。這些特殊的翻譯因子存在于翻譯的每一步中(詳情見下表)。原核和真核的翻譯過程整體上是相似的,但在部分過程中依然存在著區別。

在起始階段,核糖體的小亞基會引發t-RNA掃描mRNA,識別并結合mRNA5’端的起始密碼子(AUG)。核糖體的大亞基和小亞基在起始密碼子處鏈接并形成起始復合物。蛋白因子和mRNA參與到起始密碼子的識別和起始復合物形成的過程中。延長階段,tRNA會結合到特定的氨基酸上(這通常被稱為tRNA的裝載作用)并在核糖體中聚合形成肽,氨基酸通過轉錄產物的mRNA序列不斷添加到正在增長的肽段中。最終,新生多肽在終止密碼子處停止翻譯。同時,核糖體釋放mRNA,準備開始新一輪的翻譯。

蛋白合成

原核生物與真核生物翻譯過程中的主要組成部分概述

組成 原核 真核
核糖體 30S和50S亞基 40S和60S亞基
模板或mRNA 轉錄后,mRNA轉錄產物不需要進一步的修飾
mRNA是多順反子并包含多個起始位點
轉錄后,mRNA除去非編碼區(內含子),并且在mRNA的5’端和3’端分別加入“帽子”結構(M7甲基鳥嘌呤)和聚腺苷酸序列。
“帽子”結構和poly A尾在mRNA轉移到細胞質的過程起到很重要的作用,可以保證翻譯的正確性以及mRNA在其他功能中的穩定性。
mRNA通常是單順反子。
翻譯的特點 Shine-Dalgarno序列存在于mRNA轉錄物中,是核糖體亞基中的一段互補序列。
SD序列有助于mRNA在起始位點與核糖體的結合準確。
新生多肽的第一位氨基酸是甲酰化的甲硫氨酸。
翻譯的起始發生在倆個方面:
Cap-dependent翻譯:“帽結構”和帽結合蛋白負責核糖體結合mRNA并識別正確的密碼子。mRNA的5’端第一個AUG密碼子作為起始密碼子,有時Kozak 序列會出現在起始密碼子附近。
Cap-independent翻譯:核糖體與mRNA是通過mRNA的“內部核糖體進入位點”(IRES)進行結合。
起始因子 三個已知啟動因子:IF1,IF2,IF3 三個以上的經磷酸化調節的起始因子,在真核翻譯中,啟動步驟通常是限制步驟(rate-limiting step)
延伸因子 EF-Tu,EF-Ts,EF-G EF1(α, β, γ)和EF2
終止或釋放因子 RF1和RF-2 eRF-1

翻譯后修飾

翻譯后的多肽會采用多種加工方式來完成其蛋白結構或調節細胞活性。翻譯后修飾(PTMs)是指各種添加或改變蛋白化學結構的方法,PTMs在整體細胞生物學中起到至關重要的作用。

翻譯后修飾的類型包括:

  1. 通過分子伴侶的幫助,多肽折疊成一個能量處于最低的狀態球狀蛋白。
  2. 氨基酸的修飾,如第一個甲硫氨酸殘基的去除
  3. 二硫鍵的形成或減少
  4. 促進結合功能的蛋白質修飾
    • 糖基化
    • 蛋白異戊二烯化對膜的定位
    • 組蛋白乙酰化修飾DNA組蛋白的相互作用
  5. 為了保證蛋白活性而添加的官能團:
    • 磷酸化
    • 亞硝基化
    • GTP結合

蛋白表達與純化的方法

在一般情況下,蛋白質組學研究涉及調查的一個蛋白的許多方面,如結構、功能、修飾、定位或蛋白質的相互作用等。為了研究特定蛋白的生物學調節作用,研究人員通常需要采用生產手段制造出感興趣的功能蛋白。

對于已知大小和復雜性的蛋白,不能采用化學合成的方法。相反,活細胞及其細胞器通常被作為模板基因合成蛋白的場所。

不同的蛋白質,既可以使用簡單的DNA綜合構建,也可以利用已知的DNA序列在體外重組構建。因此,特殊基因的DNA模板無論帶不帶額外的親和標簽序列,均可以構造為表達模板。通過這樣的重組DNA模板表達出來的蛋白被稱為重組蛋白。

體內蛋白表達

傳統蛋白表達純化方式包括重組載體轉染細胞,細胞培養以及轉錄翻譯目的蛋白。通常情況下,會先裂解細胞提取蛋白,并對提取的蛋白進行純化。原核細胞和真核細胞的體內蛋白表達系統已被廣泛應用,系統的選擇取決于表達蛋白的種類,功能活性和預期收益等。

原核表達系統具有易于培養,增長快速和產量高等優點。然而,多域(multi-domain)真核蛋白在細菌內的表達往往是不成功的,因為細胞無法滿足翻譯后修飾或分子折疊的需求。同時,許多表達的蛋白很容易形成不溶性的包涵體——如果沒有合適的變性劑和復雜的復性程序很難恢復蛋白的天然構型。

哺乳動物體內表達系統雖然會產生活性蛋白,但也有著產量低,生產成本高以及細胞培養時間長等缺點。此外,在體內的表達系統不利于高通量(high throughput protein)蛋白合成或對宿主細胞有毒性的蛋白表達。

體外細胞表達(無細胞)

無細胞蛋白表達是采用全細胞翻譯兼容提取物(translation-compatible extracts of whole cells)在體外合成蛋白質。原則上,全細胞提取物中含有所有的用于轉錄,翻譯及翻譯后修飾的大分子組件。這些組件包括RNA聚合酶,調控因子,轉錄因子,核糖體和tRNA。

在添加輔助因子,核苷酸和特定的基因模板的情況下,幾小時內就可以合成目的蛋白。

雖然這種表達方式無法應用到規模化生產中,但無細胞蛋白表達系統與傳統的體內表達系統相比,仍具有很多優勢:無細胞表達系統可以使重組蛋白快速合成,免除細胞培養的麻煩;無細胞系統可以使用修飾的氨基酸標簽,以及表達會因蛋白酶而快速降解的蛋白。而且通過體外表達的方法,能夠同時表達多種不同的蛋白。(例如,通過從許多不同的重組DNA模板中進行一個小規模表達來檢測蛋白突變)

化學合成

化學合成的蛋白被應用于標記非天然氨基酸(proteins labeled with unnatural amino acids),在特定位點標記蛋白或表達對生物系統有毒性的蛋白。化學合成法能夠生產出高純度的蛋白,但這種方法只適用于小分子蛋白質和多肽。化學合成法合成的蛋白產量非常低,且價格昂貴。

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