免疫印跡(Western Blot)的常見問題(FAQ)

返回Western blot實驗原理及操作步驟

作為免疫印跡(Western Blot)的基本原理,實驗步驟的補充,本文列舉免疫印跡的常見問題(FAQ),以供參考。

下載

1. Western blot結果中的背景為什么較高?

可能的原因及建議

  1. 膜封閉不夠——延長封閉的時間;選擇更加適合的封閉液。
  2. 一抗稀釋度不適宜——對抗體進行滴度測試,選擇最適宜的抗體稀釋度。
  3. 一抗孵育的溫度偏高——建議4℃結合過夜。
  4. 膜在實驗過程中干過——實驗過程中要注意保持膜的濕潤。
  5. 檢測時曝光時間過長——減少曝光時間。

2. Western blot結果中雜帶較多

可能的原因及建議

  1. 目的蛋白有多個修飾位點(磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等),本身可以呈現多條帶。
    查閱文獻或進行生物信息學分析,獲得蛋白序列的修飾位點信息,通過去修飾確定蛋白實際大小。
  2. 目的蛋白有其它剪切本——查閱文獻或生物信息學分析可能性。
  3. 樣本處理過程中目的蛋白發生降解——加入蛋白酶抑制劑;樣本處理時在冰上操作。
  4. 上樣量過高,太敏感——適當減少上樣量。
  5. 一抗特異性不高——重新選擇或制備高特異性的抗體。
  6. 一抗不純——純化抗體
  7. 一抗或者二抗濃度偏高——降低抗體濃度。

3. Western blot結果中無信號或顯示信號弱

可能的原因及建議

  1. 檢測樣本不表達目的蛋白——選擇表達量高的細胞作為陽性對照,用于確定檢測樣本是否為陰性。
  2. 檢測樣本低表達目的蛋白——提高上樣量,裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
  3. 轉移不完全或過轉移——可以用麗春紅染膜并結合染膠(考馬斯亮藍)后確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭;適當調整轉膜的時間和電流。
  4. 抗體不能識別測試種屬的相關蛋白——購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書,確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。
  5. 一抗孵育時間不足——建議4℃結合過夜。
  6. 二抗與一抗不匹配——選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
  7. 洗膜過度——洗膜時間不宜過長,加入的去垢劑不宜過強或過多,建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

4. 其它現象:

  1. 膜上多處出現黑點或黑斑——抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。
  2. 反白(條帶顯白色)——目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。
  3. 蛋白分子量偏低或偏高——膠濃度不適合,高分子量要用低濃度膠;小分子蛋白要用高濃度膠。

5. TBS與PBS的區別

PBS的緩沖能力強于TBS(因為混合緩沖液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩沖范圍),TBS在PH7.0以下緩沖能力較弱(不過PBS易污染)。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩沖液,如在蛋白純化中進行陰離子交換層析,陽離子緩沖液首選TBS;陽離子交換層析時,陰離子緩沖液則首選PBS。
Western blot中使用TBS和PBS均可,只是要根據需要選擇合適的濃度。

6. Western是否可以同時加兩種或者多種一抗

通常情況下只加一種一抗。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照,也是先上目的蛋白的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片;漂洗以后,再上內對照的一抗、二抗,ECL顯色、壓片、洗片。

7. PVDF與NC膜的區別

PVDF膜價格較貴,可重復使用,結合能力較強。

NC膜價格比較便宜,應用較廣,結合牢固性較PVDF膜差,韌性也不如PVDF,不能重復使用,但蛋白吸附容量高,親水性較好。

8. Western一抗的選用

理論上單抗比多抗的特異性要好,但單抗種類較少一般價格偏高,所以一般來說多抗足夠了。

9. Western抗體和ELISA抗體的區別

一般來說用于western的抗體主要識別氨基酸序列特異性;而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類,有些是識別氨基酸序列特異性,有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。

做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題,一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白,另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。

10. “短路”現象的產生和處理

如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸,這樣同樣會短路,電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行,正常的半干是慢慢變高的, 最后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。

11. Western Blot的染色

  1. 陰離子染料是較常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測極限可達到1.5μg,考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去,以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是:溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
  2. 膠體金,靈敏度高,檢測范圍可到pg級,但染色比穩定。
  3. 生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

12. 大分子量蛋白轉移效率低的解決方法

可以在轉移緩沖液中加入20%甲醇(是指終濃度),因為甲醇能增加蛋白質和NC膜的結合能力,同時可以延長高分子量蛋白質轉移時間;轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS,也是為了增加轉移效率;選用優質的轉移膜,或使用小孔徑的NC膜(0.2微米);使用戊二醛交聯。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠;提高轉移電壓/電流;增加轉移時間。

13. DAB顯色、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色原理

DAB顯色在辣根過氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產物,該產物難溶于醇和其他有機溶劑,DAB的氧化還能引起聚合作用,導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色中,酶將奈酚磷酸(底物)水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽(顯色原)結合而產生有色的、不溶性偶氮染料。

14. 酶顯色與熒光顯色的優缺點

免疫酶技術就是用酶標記已知抗體(或抗原),然后與組織標本在一定條件下反應并結合,結合形成的復合物中所含有的酶分子遇到底物時,會催化底物水解、氧化或還原,從而發生顯色反應。免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術,前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上,形成酶標記抗體。后者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應,稱為非標記抗體酶技術。

免疫熒光技術中的熒光抗體染色標本不能長期保存,對組織細胞的細微結構分辨不清,但免疫酶技術則能克服上述不足,標記免疫酶技術的敏感性更優于免疫熒光法。酶顯色產物具有較高的電子密度,經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察。

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