上清表達優化服務

原核蛋白上清表達優化型服務

南京德泰生物的上清蛋白表達服務是我們原核蛋白表達服務的高級服務項目,我們專業的技術團隊通過優化不同的表達條件,使上清中蛋白的表達量增加。在上清中表達的蛋白直接處于可溶狀態,不需經過蛋白復性,因此更接近蛋白的天然結構,在下游的實驗應用中有更好的表現。南京德泰生物憑借特有的基因序列優化技術,載體優化技術以及豐富的表達條件優化篩選經驗等多種技術硬實力來確保實現上清蛋白的高表達。
對于上清表達量低,蛋白復性后沒辦法正確折疊或對上清蛋白有特殊需求的客戶,德泰原核上清表達優化型服務是非常值得信賴的選擇。

服務內容

客戶提供 實驗周期 交付
提供序列 6~8周
  • 表達載體/表達菌株;
  • 項目報告及COA;
  • 蛋白/條件優化報告;

附:實驗報告可以包括表達載體優化報告、表達條件優化報告、蛋白質可溶性及得率評估報告等。

服務流程

德泰蛋白表達上清優化型服務流程
A)密碼子優化與基因合成:德泰自主研發的MaxCodon?密碼子優化軟件,有效提升蛋白表達水平。
B)質粒的選擇與亞克隆:選擇合適的質粒,并將目的基因亞克隆至載體上
C)菌株的選擇與轉化:選擇合適的菌株,并將帶有目的基因的質粒轉化至菌株內
D)蛋白表達與表達條件優化:從表達溫度,誘導劑濃度,培養基種類等多個方面進行48種表達條件的優化
E)離心并進行上清分析:取細胞液進行破碎,離心并進行上清分析
F)選出最適合的表達條件
G)提交項目報告
H)擴大培養(可選)

優化項目

優化項 優化原理 優化內容
密碼子優化 密碼子的簡并性 優化內容包括:
稀有密碼子優化
mRNA結構優化
tRNA濃度優化
載體優化 根據蛋白選擇合適的質粒,增加可溶性蛋白表達量 pET系列:pET30a,pET28a
pCold載體(用于低溫表達)
其它內部構建載體
表達菌株優化 根據蛋白性質選擇合適表達菌株,增加蛋白表達量及可溶性表達量 增加mRNA穩定性:BL21 Star (DE3) 菌株
促進二硫鍵的形成以及蛋白的折疊:OrigamiB(DE3)菌株
蛋白序列中含有稀有密碼子:Rosetta(DE3)菌株、BL21 CodonPlus(DE3)菌株
其它菌株
內含子含量 高濃度的內含子對于細胞有潛在毒性,并且更易形成包涵體 降低內含子溶度
融合標簽選擇 融合標簽可以增加蛋白的可溶性表達,超過70%的蛋白質測試顯示,可溶性表達高的蛋白中至少結合兩個融合標簽 選用的融合標簽有:
GST、MBP、NusA、Trx
表達條件優化 選擇有利于蛋白可溶性表達的條件,增加蛋白可溶性表達 48種表達條件優化,選出最適合的表達條件
分子伴侶 分子伴侶的功能是可提高蛋白的可溶,促進蛋白的正確折疊 常用的分子伴侶有:
GroES-GroEL
DnaK-DnaJ-GrpE

Tips:??48種優化條件由3個載體條件、4個感受態條件、3種誘導劑濃度條件、3種溫度條件以及2種時間條件組合而成(不同蛋白性能不同,各個條件數量稍有區別)。

案例分析

案例中的蛋白為正常情況下表達量極低的蛋白(上清中純化后得不到目的蛋白)。對該蛋白進行溫度、誘導劑溶度、誘導時間、表達菌株選擇等表達條件的優化。實驗結果如下圖:

德泰蛋白表達上清優化型服務案例電泳圖
圖1. 蛋白不同表達優化條件下的上清液電泳圖
德泰蛋白表達上清優化型服務案例純化圖
圖2.優化后的上清蛋白純化電泳圖
圖片15

該蛋白在進行表達條件優化后,得率提升了2-3倍。
在進行表達條件優化后,目標蛋白在上清中的表達量有了顯著的增加。

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