酶解法與表達系統制備Fab流程簡述

下載

酶解法制備Fab

利用木瓜蛋白酶生產Fab片段

  • 取實驗室自制的抗體或IgG粉末置于0.01mol/L的PBS(ph=7.4)中透析3h,調整抗體濃度1mg/mg。
  • 將木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液(0.1mol/L PBS,ph=7.4,其中加入0.2mol/L EDTA和0.01mol/L半胱氨酸),配置成1mg/mL的溶液。37℃活化20min。
  • 將木瓜蛋白酶與抗體溶液按1:10的比例混合,在37℃下反應6h。
  • 將反應完產物使用10kDa的超濾管在4000rmp,4℃下超濾,除去木瓜蛋白酶,同時替換溶劑為0.01mol/L的PBS(pH=7.4),溶解后的溶液即為Fab片段與Fc片段的混合物。
  • 對酶解產物進行純化。

利用胃蛋白酶生產F(ab’)2并進一步生產Fab’片段

  • 將IgG粉末100mg,溶于2 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸緩沖液。溶液稍成白濁,30℃,保溫10min
  • 取結晶胃蛋白酶1.5 mg,溶于1.5 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸緩沖液,加于步驟1的溶液中,于30℃作用16h
  • 用0.1 mol/L pH8.0 PBS透析一夜
  • 加入硫醇,使成0.1 mol/L,在室溫下攪拌30min
  • 加入1 mol/L的碘乙酰胺Iodoacetamide)使成為0.1 mol/L,室溫下攪拌1h
  • 用0.01 mol/L PBS 1000L透析過夜,3000r/min,離心30min,去沉淀
  • 把上清過SephadexG100 (40cm×2.0cm)以0.1 mol/L PBS洗脫
  • 以每管6mL收集,約在第8管開始,Fab’片段被洗脫
  • 測OD280nm,將Fab’管合并,濃縮、凍干
  • 如制備F(ab’)2,上述4~6步驟則可以省略

Fab片段制備(大腸桿菌表達系統)

以嵌合抗CD 20抗體Fab片段在大腸桿菌中表達為例[1](下文中提到的載體與表達菌株均由該實驗室自行構建)
表達載體構建

  • 利用PCR法從抗CD20ScFv表達載體上擴增VH、VL基因,經瓊脂糖電泳分離純化后,分別以限制性內切酶MluI+ApaI、MluI+StyI消化,然后重組到帶有人免疫球蛋白相應CH1、CL的pYZH1、pYZL載體相應的內切酶位點中,得到重組子pYZH1cd20、pYZH1cd20。
  • 用所得的重組子轉化大腸桿菌菌株,擴增培養后提取pYZLcd20、pYZH1cd20質粒,分別以限制性內切酶MluI+NheI,SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZH1cd20。
  • 瓊脂糖電泳分離純化含VL、VH的相應DNA片斷,利用NheI、SpeI同裂酶的特點,將這兩個片斷和經MluI+SphI消化所得的pYZF載體片斷連接成抗CD20Fab表達載體pYZF1cd20。

可溶性表達及分離純化

  • 將載體pYZF1cd20轉入大腸桿菌菌株,經篩選與擴大培養后,挑取陽性克隆單菌落接種5 ml含氨芐青霉素50 μg/ml的2×YT培養基(蛋白胨6%,酵母膏1%,氯化鈉0.5%,pH7.4),37℃,200 r/min,振蕩培養6 h,至OD600=0.6;6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌株。
  • 將菌株重新懸浮于20 ml含氨芐青霉素50 μg/ml的AP5培養基(每1 000 ml含酸水解酪蛋白11 g,酵母膏0.6 g,硫酸鎂0.19 g,葡萄糖1.5 g,氯化銨1.07 g,氯化鉀3.73 g,氯化鈉1.2 g,1 mol/L三乙醇胺(pH7.4)120 ml,過濾滅菌),30℃,250 r/min,振蕩培養20 h;6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體。
  • 將菌體于-20℃凍存1 h,化凍后加1 ml細菌周質腔蛋白提取液,混勻,置于4℃輕搖1 h,12 000 r/min,4℃離心20 min,取上清。
  • 用Protein G Agrose親和柱分離純化Fab。

蛋白質印跡實驗(Western-blot)

Fab片段制備(哺乳動物表達系統)

利用哺乳動物表達系統進行Fab片段制備的表達流程為我司內部資料。如需制備服務,請查看抗體片段制備服務頁面

引用:[1] 賴增祖,熊冬生,范冬梅,彭輝,許元富,朱禎平,楊純正等。嵌合抗CD 20 抗體Fab片段在大腸桿菌中表達及活性鑒定[J],中國免疫學雜志,2000,16(10),522-523。

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